Synthesis of FITC-Labeled Modified Mg / Al-Cl Double Layered Hydroxide (LDH) Based Nanoparticles and Their Use in Sperm-Mediated Gene Transfer (SMGT)


Creative Commons License

Şentürk S., Bal K., Gök M. K. , Demir K., Pabuccuoğlu S., Pabuccuoğlu S. K.

32. Ulusal Kimya Kongresi, Eskişehir, Turkey, 17 - 19 September 2020, pp.69

  • Publication Type: Conference Paper / Summary Text
  • City: Eskişehir
  • Country: Turkey
  • Page Numbers: pp.69
  • Istanbul University-Cerrahpasa Affiliated: Yes

Abstract

Sentetik çift tabakalı hidroksitler (LDH) hidrotalsit benzeri anyonik bileşikler olup, kil minerallerine oldukça benzer fiziksel ve kimyasal özelliklere sahiptir. LDH, iki değerlikli (Mg²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺ vb.) ve üç değerlikli metal katyonların (Al³⁺, Fe³⁺, Ga³⁺ vb.) oluşturduğu pozitif yüklü tabakaların istiflenmesi ile benzersiz bir yapıya sahip olmaktadır. Tabakalar arası boşluklarda ise su molekülleri ve değiştirilebilir anyonlar (Cl⁻, NO₃⁻,CO₃²⁻ vb.) bulunmaktadır. Sahip oldukları anyon değiştirme özellikleri onları floresan boya molekülleri, herbisitler, vitaminler, aminoasitler, antibiyotikler, çeşitli farmasötik ilaçlar ve daha da önemlisi DNA ve RNA gibi fonksiyonel nükleik asitler gibi negatif yüklü moleküller için mükemmel taşıyıcılar haline getirmektedir. LDH’in sahip olduğu yüksek biyouyumluluk, düşük sitotoksisite, yüksek yükleme kapasitesi, sentezinin kolay ve düşük maliyetli olması, partikül boyutunun ayarlanabilir olması, kimyasal kararlılığı, modifikasyona elverişli olması, hedeflendirilebilir ve pH’a duyarlı salım özelliği, tabakalar arasındaki molekülleri kimyasal ve biyolojik etmenlerden koruması gibi pek çok özelliği onu gen transferinde kullanılması için oldukça uygun bir viral olmayan vektör haline getirmektedir. Bu çalışmada, öncelikle birlikte çöktürme yöntemi ve ardından hidrotermal işlem uygulanarak Mg/Al-Cl LDH nanopartikülleri sentezlendi. Sperm aracılı gen transferinde (SMGT), spermatazoonun kendisi gen taşıyıcı vektör olarak kullanıldığından, fertilizasyon sonrası embriyo gelişimi en az oranda etkilenmektedir. Ancak bu sistem kullanırken oosit ile gen taşımayan spermatazoonun birleşmesi dolayısıyla transgenik embriyo oluşmaması büyük dezavantaj oluşturmaktadır. Bu nedenle gen taşıyan spermatazoonun belirlenmesini sağlayan toksik olmayan işaretleyici sistemlerin geliştirilmesine ihtiyaç vardır. Bu amaçla ilk olarak LDH’in floresan izotiyosiyanat (FITC) ile modifikasyonuyla spermatozoonları işaretleme kabiliyeti olan aynı zamanda pEGFP-N1 plazmidini de taşıyabilecek LDH-FITC bileşiği oluşturuldu. Modifikasyon öncesi sentezlenen LDH nanopartiküllerinin boyutu, boyut dağılımı (PDI) ve zeta potansiyeli Zetasizer Nano Series (Malvern Instruments, England) cihazı kullanılarak, boyutu 122 nm, PDI=0,219 ve zeta potansiyeli 45,7 mV olarak, modifikasyon sonrası ise boyutu 136,8 nm, PDI=0,366 olarak ölçüldü. Sentezlenen ve modifiye edilen nanopartiküllerin karakterizasyonu FTIR ve XRD analizleri ile yapıldı. LDH-FITC nanopartiküllerinin
gen taşıma kapasitesi Jel elektroforez ile saptandı ve LDH-FITC:Gen (a/a) oranı 28:1 olarak belirlendi.

LDH-FITC-Gen kompleksi ile koç sperması inkübasyonu sonucu motilite oranları ısıtma tablalı faz contrast mikroskopta incelendi, LDH-FITC-Gen kompleksinin tutunduğu spermatozoon oranı ise Guava® easyCyte 6-2L (Merck, France) Akan Hücre Ölçer Akım Sitometresi ile tespit edildi. 60:2,16 (a/a) oranında LDH-FITC-Gen kompleksi ile 30 dk. inkübe edilen spermatozoonların %37,64’lük kısmına bu kompleksin tutunabildiği ve motilite oranının %40 olduğu tespit edildi. Sonuç olarak gen taşıyan spermatozoonların işaretlenmesinde, geliştirmiş olduğumuz Mg/Al-Cl LDH esaslı modifiye nanopartikül sisteminin  spermatozoonun hareket kabiliyetinde önemli bir düşüş yaratmadan SMGT çalışmalarında kullanılabilecek bir işaretleme sistemi olduğu ortaya koyulmuştur.
“BU ÇALIŞMA İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ-CERRAHPAŞA BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ TARAFINDAN DESTEKLENMİŞTİR. PROJE NO:TSG-2017-20659”