Effects of Extracellular Vesicles Derived from SOEC on In Vitro Development and Quality of Sheep Embryos

Israa Faris Mohamed Faris

Effects of Extracellular Vesicles Derived from SOEC on In Vitro Development and Quality of Sheep Embryos

Tezin Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa, Veteriner Fakültesi, Klinik Bilimler Bölümü, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2022

Tezin Dili: İngilizce

Öğrenci: Israa Faris Mohamed Faris

Danışman: Sema Birler

Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu

Özet:

Ovidukt; gamet olgunlaşması, taşınması ve spermatozoanın oositlere doğru yönlendirilmesi için uygun mikro ortamı sağlayan, başarılı bir fertilizasyon ve erken embriyo gelişimi için elzem olan bir organdır. Embriyo ve annenin reprodüktif kanalı arasındaki etkileşim (EV'ler gibi sinyallerin etkileşimi), başarılı embriyonik gelişim için çok önemlidir. Ovidukt, erken embriyonun maruz kaldığı ilk ortamdır ve bu yüzden embriyo ile anne arasındaki sinyallerin başlangıç noktası olduğu düşünülmektedir. Oviduktal epitel hücrelerinden türetilen EV'lerin (oEV'ler) rolünün ne olduğu henüz tam olarak anlaşılmamıştır. Bu konuda son yıllarda gerçekleştirilen çalışmalarla EV'lerin reprodüktif sistemde oynadıkları roller anlaşılmaya çalışılmaktadır. Oviduktal EV'lerle ilgili gerçekleştirilen en son çalışmalarda, EV'leri izole etmek için yoğunluk gradyanı, ultrasantrifüj/seri santrifüj, polimer bazlı presipitasyon ve ticari kitlerle immünoafinite gibi çeşitli yaklaşımlar kullanılmıştır. Mevcut literatüre bakıldığında, oviduktal EV'lere odaklanan çalışmaların sayısı, uterus EV'leri ve foliküler sıvı EV'leri gibi dişi reprodüktif organlarından türetilen diğer EV'lerle karşılaştırıldığında daha azdır. Çoğu çalışmada, ultrasantrifüj tekniği, oEV'leri izole etmek için tercih edilen bir teknik olmuştur. Çünkü bu çalışmaların çoğunda oEV'lerin gamet\embriyolar üzerindeki fonksiyonel etkilerini araştırmak amaçlanmıştır. Sunulan çalışmada, yardımlı üreme tekniklerinde gebelik oranlarını iyileştirme konusunda esas olan in vitro embriyo üretimi üzerine ovidukt epiteli kaynaklı EV'lerin etkilerine odaklanılmıştır. Mevcut hipotezin amaçları, ilk olarak, koyun ovidukt epitel hücrelerinden (SOEC) koşullandırılmış (conditioned)-medyum toplamak için tek katmanlı SOEC hücre kültürünü elde etmekti. Daha sonra, ekstraselüler veziküller (EV), koşullandırılmış ortamdan sıralı ultrasantrifüj ile izole edildi ve nano-tracking analizi ile karakterize edilerek konsantrasyonu saptandı. SOEC-koşullandırılmış ortamdan oEV'lerin izolasyonundan sonra, SOEC'den türetilen EV'ler embriyo in vitro kültür ortamına eklenerek, EV'lerin embriyo gelişimi ve kalitesi üzerindeki etkileri araştırıldı. Ovidukt epitel hücre kültürü, oEV'lerinin rolünü incelemek için temel bir işlemdir. Bu çalışmada, koyun ovidukt epitel hücrelerinin izolasyonunu gerçekleştirmek için iki yöntem kullanılmıştır. Üzerinde dominant folikül ve korpus luteum bulunmayan yumurtalıklar, uzunlamasına açıldı. Ovidukt iç yüzeyindeki hücreler steril bir lam kullanılarak (bir kez) kazındı, içinde doku kültürü medyumu bulunan bir tüp içerisine toplandı ve sonra ekildi. Kullanılan diğer yöntem ise yıkama tekniğiydi. Bu teknikte öncelikle ovidukt boylamasına steril bir petri kutusunun içerisine sıkıldıktan sonra, ovidukt lümeni aynı petri kabı içerisine %10 FCS ilaveli 1 mL DMEM medyumu ile yıkandı. Sağlıklı ve açık renkli hücre kümeleri toplandı ve kültür medyumu (%10 FCS ilaveli DMEM) bulunan bir petri içerisine ekildi. Kültür medyumu, hücreler %90 konfluensiye ulaşana kadar her 48 saatte bir değiştirildi. Hücrelerin yayılması %90 civarına ulaştığında, medyum atıldı, yerine %10 oranında EV-depleted (EV'lerden arındırımış) FCS ilave edilmiş DMEM eklendi ve hücreler 24 saat bu ortamda inkübe edildi. İnkübasyondan sonra, SOEC-EV'leri izole etmek için koşullandırılmış-medyum toplandı. Sıyırma yöntemi ile elde edilen 27 mL ve yıkama yöntemi ile elde edilen 10 mL olan koşullandırılmış-medyuma sıralı ultrasantrifüj tekniği uygulandı. Bu yöntemde öncelikle, kalıntıları ve ölü hücreleri uzaklaştırmak için 300 g'de 10 dakika santrifüj yapıldı. Süpernatan alındı ve apoptotik cisimlerin uzaklaştırılması için 2000 g'de 20 dakika santrifüje edildi. Tekrar süpernatan alınarak büyük veziküllerin atılması için 10.000 g'de 30 dakika ve 20.000 g'de 40 dakika santrifüjlendi. Son olarak, süpernatan 100.000 g'de 60 dakika santrifüje edildi. Son santrifüjden sonra süpernatan tamamen atıldı ve santrifüj tüpleri EV'leri çözmek için 1 mL fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkandı. Elde edilen EV'nin boyutlarını ve konsantrasyonunu belirlemek için Nano İzleme Analizi (NTA) gerçekleştirildi. Yıkama yöntemiyle elde edilen SOEC-EV'lerin konsantrasyonu ve tek bir EV'nin ortalama boyutu sırasıyla 3.46x109 partikül/mL ve 200 nm olarak değerlendirildi. Kazıma yöntemiyle elde edilen SOEC-EV'lerin konsantrasyonu ve ortalama boyutu sırasıyla 9.80x109 partikül/mL ve 184 nm olarak değerlendirildi. SOEC'den türetilen EV'lerin embriyo gelişimi ve kalitesi üzerindeki etkilerinin incelenmesi amacıyla, izole EV'ler in vitro embriyo kültür ortamına eklendi ve embriyoların yarıklanma ve blastosist oranları, ayrıca embriyo kalitesi değerlendirildi. Embriyo kültür medyumu (SOFaa) içerisine, düşük EV (9.8x106 EV/50µL), orta EV (49x106 EV/50µL) ve yüksek EV (98x106 EV/50µL) konsantrasyonlarında SOEC'den türetilen EV'ler katıldı ve hiç EV katılmayan kontrol grubu ile karşılaştırıldı. Yarıklanma (2. Gün) ve blastosist gelişimi (8. Gün) değerlendirildi. Tüm grupların (Kontrol, Düşük EV, Orta EV ve Yüksek EV) yarıklanma ve blastosist oranları sırasıyla %68.40, %64.66, %66.00, %59.53; ve %23.39, %33.54, %29.09 ve %26.80'dir. Gruplar arasında dikkate değer farklılıklar olmasına rağmen, istatistiksel olarak sonuçlar arasındaki farklar anlamlı olmadı (p>0.05). Kontrol, Düşük EV, Orta EV ve Yüksek EV gruplarındaki blastosistlerde toplam hücre sayısı (±SEM) sırasıyla 142.75±11.93, 298.25±36.11, 225.33±15.38 ve 279.38±15.32 olarak saptandı. EV eklenen gruplarda blastosistlerin daha kaliteli oldukları saptandı (p<0.05). Sunulan çalışma, koyun ovidukt epitel hücrelerinden elde edilen EV'lerin ilk kez tanımlandığı bir çalışmadır. Ayrıca elde edilen sonuçlar, embriyo-ovidukt kanalı ilişkilerinin modülatörleri olarak kabul edilen EV'ler gibi, SOEC'den üretilen EV'lerin embriyo gelişimini ve kalitesini iyileştirdiğini göstermektedir.