Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa, Veteriner Fakültesi, Klinik Bilimler Bölümü, Türkiye
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: Kelvi Shehu
Danışman: Ramazan Arıcı
Özet:
Tavşanlar genel olarak laboratuvar hayvanı olarak kullanılmaktadır. Bazı ülkelerde kırmızı et sektörü içerisinde az da olsa yeri bulunmasına rağmen ülkemizde bu oran sektörel olarak yok denilecek kadar az bir yer tutmaktadır. Tavşan spermasının daha iyi sonuçlar sağlayabilecek biçimde soğutulması ve/veya dondurulması suni tohumlamada başarı oranın artmasına ve değerli damızlıkların daha etkin kullanılmasına olanak sağlayacaktır.
Tavşanlarda suni tohumlama, tavşan eti üretimi yapılan özellikle İtalya ve Fransa gibi birçok Avrupa ülkesinde çiftliklerde rutin olarak kullanılmaktadır. Gün geçtikçe uygulama sayısı ve bunun sonucunda da hayvan sayıları da artmaktadır. Suni tohumlama genellikle soğutulmuş spermanın kısa süre saklanması ile yapılmakta ve yüksek doğurganlık oranları elde edilmektedir (Castro ve ark. 1999, Roca ve ark. 2000, Lopez ve ark. 2005). Dondurularak saklanan tavşan sperması ile suni tohumlama, dondurulmuş-çözülmüş sperma kullanımıyla ilgili problemler nedeniyle yalnızca deneysel olarak veya gen kaynaklarının korunması için kullanılmaktadır.
Diğer türlerde olduğu gibi kriyoprezervasyon tavşan spermatozoon yapısında da hasara neden olmaktadır. Dondurma işlemleri sonrasında akrozom bölgesinde hasarlar oluşmakta, spermatozoon motilitesinde ve canlı spermatozoon yüzdesinde düşüş görülmektedir.
Tavşan spermasının dondurularak saklanmasına yönelik teknolojilerin üretilmesi ve geliştirilmesi transgenik tavşan hatlarının başarıyla ve düşük maliyetlerle saklanabilmesine de olanak sağlayacaktır.
Ayrıca laboratuvar hayvanı olmayan bazı tehlike altındaki tavşan ırklarının neslinin tükenmemesi için korunmasına ihtiyaç vardır. Bunun için de spermanın kriyoprezervasyonu önemli bir rol oynamaktadır.
Başarılı bir sperma dondurma işlemi yapmak için spermatozoonların ultrastrüktürel yapısını, özelliklerini ve kalitesini korumak gerekir. Bu nedenle sulandırıcı bileşiminin, kriyoprotektanların ve kriyoprotektan seviyelerinin yanı sıra her bir tür ve hatta ırk için sperm kriyoprezervasyon protokolünün ayarlanması gereklidir. Bunların hepsi için evrensel bir protokol yoktur.(Moce ve ark.2009)
Tavşan spermatozoonu, düşük su geçirgenlik katsayısı ve yüksek aktivasyon enerjisine sahiptir. Bu düşük su geçirgenlik değeri, tavşan sperma kriyoprezervasyonu için gliserol veya yumurta sarısına kıyasla daha düşük moleküler ağırlığa ve daha yüksek geçirgenliğe sahip kriyoprotektanların (DMSO veya amidler gibi) kullanılması daha uygun olacağını ortaya koymuştur (Curry ve ark. 1995).
Tavşan spermasının dondurularak saklanması için geliştirilen sulandırıcıların çoğu, non permebl kriyoprotektanlarla kombinasyon halinde veya bir permeabl kriyoprotektan içermektedir. Sulandırıcılara iki kriyoprotektan (genellikle DMSO ve gliserol) dahil edilmesi, tavşan spermasının dondurularak saklanmasında yaygın bir uygulamadır (Stranzinger ve ark. 1971, Rohloff ve ark. 1976, Weitze ve ark. 1976, Gotze ve ark. 1976, Bamba ve ark. 1990). Tavşan sperma kriyoprezervasyonu için sulandırıcıların yapılarına göre (permabl/nonpermabl) kriyoprotektanların konsantrasyonları dikkate alınarak optimize edilmesi gerektiği de gösterilmiştir. Farklı özellikte sulandırıcılar denenerek tavşan spermasının dondurulmasında başarı oranı arttırılmaya çalışılmaktadır (Hall ve ark. 2017, Ucan ve ark. 2016, Aksoy ve ark. 2014).
Normalde X ışını kontrast maddesi olarak geliştirilen iodixanol, son yıllarda hazırlanan sperma sulandırıcılarında da kullanılmaktadır (Saragusty ve ark. 2009). “Suda çözünebilen ve iyonik olmayan iodixanol hücre membranından serbest difuzyonla geçememektedir” (Kjeken ve ark. 2001, Schwuchow ve ark. 2002). Ancak hücre dışı solüsyonda bulunması halinde sıvı faz endositozu yoluyla bir miktar iodixanolün hücrenin içerisine nüfuz edebileceği ileri sürülmektedir (Kjeken ve ark.2001). İodixanol’ün spermatozoonları hangi mekanizmayla koruduğu tam olarak bilinmemektedir. İodixanol’ün, cam yapıya geçiş sıcaklığını (Tg) arttırdığını ve donma esnasında meydana gelen buz kristallerinin yapısını spermatozoonlara zarar vermeyecek veya daha az zarar verecek bir forma dönüştürdüğü tespit edilmiştir. Boğa sperma sulandırıcılarına belirli dozlarda iodixanolün eklenmesi, spermatozoonun membran bütünlüğünü ve işlevselliğini koruyup olumlu yönde etkilediği, eritme sonrasında motilitenin korunmasında etkisinin olduğu gösterilmiştir (Saragusty ve ark.2009). ROS üretimi, kriyoprezervasyonda özellikle kromatin hasarına yol açabilen, memeli spermatozoon canlılığı için bir sorun kaynağıdır (Hammadeh ve ark. 2001). Çalışmalarda bu tür sorunları hafifletmek için kriyoprotektan olarak iodixanol kullanılmıştır. Köpeklerde yapılan çalışmalarda (Dimas ve ark 2019) bulunan optimal iodixanol konsantrasyonu %1,5 iken; sığırlarda %2,5 (Saragusty ve ark. 2009) ve mandalarda da (Swami ve ark.2017) yine benzer şekilde %2,5 bulunmuşken bu oran koçlarda (Cirit ve ark.2013) %5 bulunmuştur. Sıçanlarda (Kim ve ark.2016) ise bu oran %1 ve %2 gibi değişken oranlarda bulunmuştur. Bu madde birçok hayvan türünde ve değişik oranlarda kullanılmış olmasına rağmen henüz tavşanlarda kullanılmamıştır.
Etki mekanizması tam olarak aydınlatılmamış olsa da, iodiksanolün boğa ve koç spermasında sulandırıcılara ilave edilmesi ve donma/eritme aşamalarında; spermatozoonların membran bütünlüğünün ve motilitesinin korumasında etkili olduğu bildirilmiştir. Tavşanlarda da benzer olumlu etkilerinin olabileceği düşünülmektedir. Spermatolojik değerlerdeki olumlu etkileri için hangi dozlarda kullanılmasının daha uygun olacağı araştırılacaktır.
Bu çalışmada ilk olarak iodixanolun tavşanlarda sulandırıcı olarak kullanılabileceği optimal dozunun saptanması için; %0, %2.5, % 5 ve %10 oranında sulandırıcıya katılacak ve soğutulmuş sperma ile ön denemeler yapılacaktır. İkinci aşamada ise optimal doz aralığı belirlendikten sonra sperma dondurma aşamasına geçilecektir. Dondurulan spermalar eritildikten sonra veriler toplanıp iodixanolün soğutma aşamasındaki optimal dozunun donma aşamasında spermatozoa üzerinde olumlu etkilerinin olup olmadığı araştırılacaktır.