Metilasyon, Hidroksi-Metilasyon Tayini için LC-MS/MS ile Yöntem Geliştirilmesi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa, Adli Tıp ve Adli Bilimler Enstitüsü, Fen Bilimleri Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2022
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: Aleyna İlhan
Danışman: Selda Mercan
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:20.yüzyılın ortalarında hayatımıza girmiş olan ''epigenetik'' terimi, günümüzde giderek önemini artırmaya devam etmektedir. Başlarda yalnızca genler ile fenotipi ortaya çıkaran gen ürünleri arasındaki nedensel etkileşimleri inceleyen bir bilim dalı olarak tanımlanan epigenetik, bilimin ve teknolojinin gelişimiyle birlikte birçok alanda canlı mekanizmasının bir parçası olarak ortaya konmuştur. Epigenetik mekanizmalar arasında en çok çalışılan mekanizma metilasyondur. İncelenen deoksiribonükleik asit (DNA) metilasyon düzeyleri, insan genomundaki farklı dokular veya farklı bireyler arasındaki ayrımın yapılmasına olanak sağlamaktadır. Ayrıca şimdiye kadar birçok hastalıkla ilişkisi ortaya konulmuş olan metilasyon, hastalıkların temel mekanizmalarının çözümlenmesinde ve kişiye özgü tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Birçok bilim dalında önemli bir yeri olan DNA metilasyonu, adli bilimler için de oldukça değerlidir. Yapılan DNA metilasyon analizleri sayesinde adli bilimler için, yaş tayini, olay yerinde vücut sıvısı teşhisi ve monozigotik i̇kizleri birbirinden ayırma gibi uygulamalar yapılabilmektedir. Günümüze kadar global DNA metilasyon düzeylerini saptamaya yönelik birçok yöntem geliştirilmiştir. Geliştirilmiş olan yöntemlerin arasında sıvı kromatografisi-ardışık kütle spektrometresi (LC-MS/MS) duyarlılık, tekrarlanabilirlik ve maliyet açısından diğer yöntemlere göre üstünlüğünü ortaya koymaktadır. Bu projenin amacı LC-MS/MS'in avantajlarından faydalanarak, DNA metilasyon düzeylerinin ölçülmesi için her açıdan kazanım sağlanan bir yöntem geliştirmektir. Bu amaç doğrultusunda, 45 yaş altı ve 45 yaş üstü olmak üzere iki ayrı yaş grubuna ait toplamda 14 gönüllü bireyden kan ve tükürük örnekleri alınarak, DNA izolasyonu E.Z.N.A. ® Tissue DNA Kit protokolüne göre gerçekleştirildi. Bu örnekler geliştirilmiş olan LC-MS/MS yöntemi ile birlikte analiz edildi. Yapılan çalışmanın bulgularına göre %mdC=(mdC/dC+mdC+hmdC)*100 ve %hmdC=(hmdC/dC+mdC+hmdC)*100 formülleri kullanılarak yapılan hesaplamalar sonucu kan örneklerindeki (n=11) ortalama metilasyon düzeyi % 3.132 (±0.619) ve hidroksimetilasyon düzeyi %0.080 (±0.089) olarak bulunurken; tükürük örneklerinde (n=14) ortalama metilasyon düzeyi %4.186(±0.729) ve hidroksimetilasyon düzeyi % 0.038 (±0.024) olarak bulundu. Kan örnekleri ile karşılaştırıldığında, global DNA metilasyon düzeylerinin tükürük örneklerinde daha yüksek oranlarda olduğu görüldü (ρ=0.0066). Buna karşılık hidroksimetilasyon düzeyleri iki materyal arasında anlamlı bir fark olmamakla birlikte, kan örneklerinde daha yüksek değerlerde çıktı (ρ=0.207). İki biyolojik materyal arasındaki %mdC-hmdC düzeylerinde çıkan farklılıklar, bu iki materyalin analizlerde birbirinin yerine kullanılamayacağını göstermektedir. Çalışmanın kalibrasyonunu oluşturmak amacıyla seçilen MeOH ve DNA olmak üzere iki matriks arasındaki ilişki Student's t-test ile araştırıldı. Yapılan test sonucunda anlamlı bir farklılık çıkmadığı görüldü (%5mdC kan için ρ=0.887; tükürük için ρ=0.875) (%5hmdC kan için ρ=0.488; tükürük için ρ=0.424). Bu durum her iki matriksin de DNA metilasyon/hidroksimetilasyon analizi için uygun olduğunu göstermektedir. Tükürük ve kan örneklerinin kendi içerisinde mdC ve hmdC değerleri arasındaki ilişki Student's t-test ile incelendi. Test sonucunda hem kan hem tükürük örnekleri kendi içerisinde mdC ve hmdC için anlamlı bir farklılık gösterdi (kanda ρ=0.0005; tükürükte ρ=0.00004). Bu sonuçlar değerlendirildiğinde, hem kan hem tükürük örnekleri için, mdC ve hmdC düzeylerinin karşılaştırılabilir olmadığı söylenebilir. Bu çalışmada LC-MS/MS kullanılarak, insan vücudunun farklı dokularındaki DNA metilasyon ve hidroksimetilasyon düzeylerinin eş zamanlı olarak ve 5 dk gibi kısa bir süre içerisinde analiz edilmesine olanak sağlayan bir yöntem geliştirildi. Biyolojik materyal olarak tercih edilen kan ve tükürük örnekleri hem kendi içlerinde hem de birbirleri arasında incelenerek ileriki çalışmalar için önemli olabilecek bulgular ortaya kondu. Böylelikle gelecekteki epigenetik araştırmalar için yol gösterici olan ve bu çalışmaların analitik sistemler yardımıyla gerçekleştirilmesine olanak sağlayan kromatografik bir yöntem geliştirildi.