Sığırlarda Influenza D Virusunun Saptanması, İzolasyonu, Moleküler Karakterizasyonu ve Oluşan İmmun Yanıtın Araştırılması
Tez Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa, Veteriner Fakültesi, Klinik Öncesi Bilimler Bölümü, Türkiye
Tez Danışmanı: Aysun Yılmaz
Tezin Onay Tarihi: 2024
Tezin Dili: Türkçe
Desteklendiği Program: YÖK 100/2000 Programı
Özet:
İnfluenza D virusu (IDV) sığırlarda solunum yolu infeksiyonlarına neden olmaktadır. Dünya çapında farklı ülkelerde ve ülkemizde tespit edilen IDV, farklı oranlarda morbidite göstermiş ve sığırlarda önemli ekonomik kayıplara neden olan sığırların kompleks solunum yolu hastalığı (Bovine Respiratory Disease Complex=BRDC) ile ilişkili bulunmuştur. Günümüzde henüz IDV aşısı yoktur ve bu nedenle IDV için uygulanan koruma ve kontrol stratejileri hijyen ve iyi yönetim uygulamaları şeklinde yapılmaktadır. Bu tez çalışmasında IDV'nin saptanması, izolasyonu, moleküler karakterizasyonu ve immun yanıtının araştırılması amacıyla ülkemizde Marmara Bölgesi'nden örnekler toplandı. Solunum yolu hastalık belirtileri gösteren sığırlardan (n=279) alınan nazal svab ve kan örneklerinde moleküler ve serolojik yöntemler kullanılarak İnfluenza D virusu ve oluşan immun yanıt araştırıldı. Real time RT-PCR ile IDV yönünden pozitif bulunan örneklerde HRT-18 hücreleri ve embriyolu tavuk yumurtaları kullanılarak virus izolasyon çalışmaları yapıldı. Virus izolasyonu sonrasında kısmi ve tüm HEF geni temelinde sekanslama yöntemi ile filogenetik analizler gerçekleştirildi. İzole edilen virusun hemaglutinasyon (HA) titresi belirlendi ve viral proteinleri SDS-PAGE ile ayrıştırıldı ve protein bantları görüntülendi. Alınan kan örneklerinde antikor taraması amacıyla ELISA testi yapıldı. Antikor tespiti yapılan serum örneklerinde hemaglütinasyon inhibisyon (HI) testi ile titre tespiti gerçekleştirildi. Yüksek HI titresi saptanan bir serumla, IDV infeksiyonu sonucu oluşan antikorların virusun hangi ağırlıktaki (kDa) proteinlerine karşı immun yanıt oluşturduğu Western blotting yöntemiyle araştırıldı. Yapılan çalışmalar sonucunda, solunum sistemi belirtileri gösteren 279 sığırdan toplanan nazal svab örneklerin 5 tanesinde IDV-RNA'sı tespit edildi (%1,79). RT-PCR ile pozitif bulunan örneklerle HRT-18 hücre kültüründe ve embriyolu tavuk yumurtasında virus izolasyonu çalışması yapıldı. Beş (5) nazal svab örneğinden IDV izole edildi. Bu örneklerin hepsinde kısmi HEF geni ve 4 tanesinde tüm HEF geni sekanslandı. IDV'nin HEF genine ait farklı bölge ve ülkelerden araştırmacıların bildirdiği sekanslar GenBank'tan temin edildi ve bu tez çalışmasında elde edilen sekans dizileri ile filogentik analiz yapılarak soyağacı oluşturuldu. Pozitif saptanan örneklerden 2020-2021 yıllarında toplanan örnekler D/OK genogrubunda kümelenirken 2024 yılında toplanan örnekler D/Yama2019 genogrubunda kümelendiği bulundu. ELISA ile yapılan antikor tarama çalışmalarında, 279 hayvana ait serumlardan 79 tanesinde IDV antikorları tespit edildi (%28,3). Antikor saptanan örneklerde hemaglutinasyon inhibisyon testi yapılarak bu serumların HI titreleri belirlendi. Serum örneklerinde HI değerleri 128-512 HI ünitesi arasında değişkenlik gösterdi. İzole edilen virusun SDS-PAGE yöntemiyle viral proteinleri ayrıştırıldı ve bantlar görüntülendi. Yüksek HI titresi saptanan bir serumla yapılan Western blotting ile antikorların virusun hangi kDa proteinlerine bağlandığı araştırıldı ve IDV'nin 100 kDa civarında bir proteinine bağlandığı tespit edildi. Sonuç olarak, Marmara Bölgesi'nde sirküle olan IDV'lerin ülkemizde izolasyonu ilk kez yapıldı ve viruslara karşı oluşan serolojik yanıt ELISA, HI ve Western blotting ile ilk kez araştırıldı ve yüksek oranda (%28,3) seropozitiflik bulundu. Western immunobloting çalışmalarında saha infeksiyonu sonucu oluşan antikorların IDV'nin 100 kDa ağırlığındaki proteinine karşı reaksiyon verdiği görülmüş olması, aşı çalışmalarında bu proteinin dikkate alınması gerekliliğini ortaya koymuştur. Ayrıca, HEF geninin tüm genom çalışmaları sonucunda, virusun D/OK ve D/Yama2019 suşuna benzer olduğu tespit edildi. Bu nedenle, ülkemize özgün otojen aşı üretilmesi durumunda bu virusların kullanılması aşılama stratejileri açısından önem arz etmektedir.