Akademik Veri Yönetim Sistemi
Dursun E. (Yürütücü), Gezen Ak D., Kasap M., Akpınar G., ALAYLIOĞLU M.
TÜBİTAK Projesi, 1001 - Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Projelerini Destekleme Programı, 2018 - 2021
i. Amacı: Bu çalışmanın amacı yakın zamanda nöron plazma membranında bulunduğunu ilk kez gösterdiğimiz vitamin D reseptörü (VDR)’nün 1) plazma membranına nasıl çıktığını, 2) hangi bölgelerinin plazma membranına çıkışta rol oynadığını, 3) plazma membranında hangi proteinlerle nasıl ilişkiye girdiğini saptamaktır. ii.Tanıtım, özgün değeri: Sınırlı literatür bilgisi nükleer hormon reseptörü olarak tanımlanmış olan VDR’nin osteoblastların plazma membranında olabileceğine işaret etmektedir. VDR’nin literatürde ilk kez nöron plazma membranında lokalizasyonu ve bir seri membran proteiniyle ko-lokalizasyonunu gösteren bulgularımız şu anda yayın aşamasındadır. VDR’nin nöron plazma membranında lokalizasyonu, nöronlarda bilinmeyen bir çok görevinin olabileceğine işaret etmektedir. Ancak literatürde VDR’nin plazma membranına nasıl çıktığı ve hangi bölgeleri ile membranda bulunduğu ve hangi proteinlerle ilişkiye girdiğine dair neredeyse hiç bir bilgi yoktur. Diğer taraftan şimdiye kadar TÜBİTAK (107S041 ve 111S200) ve Üniversitemiz tarafından desteklenen proje sonuçlarımızdan elde ettiğimiz bulgulardan yola çıkarak “vitamin D’nin verimsiz kullanımı” terimini ilk kez tanımlamış ve AH patolojisinin sadece vitamin D eksikliğini ve vitamin D ilişkili genlerdeki değişiklikleri değil aynı zamanda vitamin D’nin verimsiz kullanımını da içerdiğini ileriye sürmüştük (Gezen-Ak vd. 2014). 111S200 ve 214S586 no’lu projelerimizin verileri ise hipotezimizi bir adım ileri götürmüş ve özellikle vitamin D varlığında amiloid beta 1-42’nin azalması, vitamin D reseptörlerinin yokluğunda amiloid beta 1-42’nin artması ve amiloid patolojisine katılan sekretaz kompleksi proteinlerinin ekspresyonlarının kompleks bir şekilde etkilenmesi, uzun senelerdir araştırdığımız vitamin D ve amiloid beta patolojisi arasındaki ilişkiyi açık bir şekilde ortaya koymamızı sağlamıştır (Gezen-Ak vd. 2017b). Çalışmalarımız sırasında VDR’nin kompleks etkilerinin sadece ekspresyonel seviyede olamayabileceği ve nöron plazma membranında bulunarak sekretaz kompleksine veya amiloid öncül proteinine (APP) komşu olabileceğine dair bir fikir geliştirdik. iii. Kullanılacak yöntem: Proje kapsamında nöron özelliği gösteren insan SH-SY5Y hücreleri kullanılacaktır. Planlanan deneyler yüksek sayıda hücre gerektirdiğinden primer nöron kültürü yerine çoğalabilen bir hat olan SH-SY5Y hücreleri seçilmiştir. Bu hücrelerde VDR’nin plazma membranına nasıl çıktığı, hangi bölgeleriyle membrana bağlandığı ve hangi proteinlerle ilişkiye girdiği araştırılacaktır. A- VDR’nin hangi bölgesi onun plazma membranına translokasyonundan sorumludur? Kırpılmış VDR proteinlerini oluşturacak olan ve DDK kuyruğu taşıyan plazmidler kullanılarak SH-SY5Y hücre hatları transfekte edilecek ve farklı boydaki VDR taşıyan transfekte hücre hattında VDR’nin plazma membranına çıkıp çıkmadığı iki farklı yöntem ile (anti-DDK antikoru ile 1- canlı hücre yüzey boyama, 2-Lipid raft izolasyonu takiben western blot) izlenecektir. Böylece hangi bölgenin plazma membranına translokasyonda rol oynadığı belirlenecektir. B-VDR’nin plazma membranına yerleşiminde hangi mekanizma rol oynar?: 1-Plazma membranına translokasyonu sağlayan post-translasyonel modifikasyonlar VDR üzerinde bulunuyor mu? Palmitolasyon bu tip modifikasyonlardan biridir, VDR üzerindeki varlığı sadece tahmin edilmektedir. Bu sebeple Palmitoyl Assay ile söz konusu modifikasyonun VDR üzerindeki varlığı kontrol edilecektir. Modifikasyonun varlığı ve hangi bölgelerde gerçekleştiğini anlamak amacıyla VDR’nin farklı bölgerini oluşturacak plazmidler hazırlanıp SH-SY5Y hücre hatları transfekte edilecek ve sorumlu bölge/bölgeler saptanacaktır. 2- VDR plazma membranına endoplazmik retikulum (ER) üzerinden taşınabilir mi? Nükleer hormon reseptörlerine ait böyle bir bilgi literatürde bulunmamaktadır. Ancak %78 doğruluğa sahip olan SignalP 4.1 ile yaptığımız analiz sonucunda insan VDR mRNA’sı üzerinde sinyal peptidi özelliği gösteren bir dizinin bulunduğunu saptadık. Bu dizi kullanılarak VDR plazmidi oluşturulacak ve plazmid kuyuruğundaki yamayı tanıyan anti-DDK antikoru ile iki farklı yöntem kullanılarak (1-canlı hücre yüzey boyama;2-Lipid raft izolasyonu takiben western blot) sinyal dizisi taşıyan proteinin plazma membranında bulunup bulunmadığı araştırılacaktır. C-VDR plazma membranında hangi proteinlerle bir aradadır? Daha önce VDR ile ko-lokalizasyonunu gösterdiğimiz ADAM10, Nicastrin gibi sekretaz kompleksleri elemanlarını ve bu sistemin substratı olan APP’yi ve FpClass PPI prediction tool yazılımında elde ettiğmiz verilere göre seçtğimiz NUMB, catenin, NOTCH1, E-cadherin, FHL2, ESR1, TGFBR gibi proteinlerin VDR ile direkt olarak bir arada bulunup bulunmadığı ko-immünpresipitasyon (Co-IP) yöntemi ile test edilecektir. D-VDR hangi bölgeleri aracılığı ile plazma membranında beraber bulunduğu proteinlerle ilişkiye girer? Kırpılmış VDR plazmidleri kullanılıp C-bölümünde birarada bulunduğu saptanan proteinler ile Co-IP deneyleri tekrarlanacak, bu şekilde VDR’nin hangi bölgelerinin membrandaki protein-protein etkileşiminde rol oynadığı tespit edilecektir. iv. Ulaşılmak istenen hedefler: VDR’nin plazma membranına nasıl çıktığı ve öngörülen proteinlerle membranda olan ilişkileri saptandığı taktirde VDR’nin klasik rollerinin dışında, temel bilgileri değiştirebilecek sonuçlara ulaşılacaktır. Bu şekilde bir hormon reseptörünün aynı anda hem gen regülasyonu hem de membrandaki çeşitli fizyolojik olaylara nasıl katılabildiği anlaşılacaktır. Diğer taraftan proje kapsamında VDR’nin birlikteliğini araştırdığımız proteinler nörodejenerasyon ile ilişkili olduğundan, nörodejenerasyon mekanizmalarını anlamamızı ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesini sağlayabilecektir. Ayrıca vitamin D’nin rolü olduğu düşünülen bir çok hastalıkta yeni çalışmaların geliştirilmesine aracılık edecektir