Akademik Veri Yönetim Sistemi
Pabuccuoğlu S. (Yürütücü), Birler S., Evecen M., Demir K., Pabuccuoğlu S. K., Gök M. K., et al.
TÜBİTAK Projesi, 1001 - Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Projelerini Destekleme Programı, 2017 - 2020
Çalışmanın başlıca amacı, Somatik Hücre Nüklear Transferi (SCNT)’nin transgenik çiftlik hayvanı üretiminde etkinliğinin artırılmasını sağlamaktır. Bu amaçla gen transfeksiyonunda koyun fibroblast hücre kültürü üzerinde etkinliği gözlenmiş olan nanopartiküllerin etkinliği vesomatik hücrelerin yeniden programlanması tekniklerinin klon embriyoların gelişimi üzerine etkileri incelenecektir. Genomunda yabancı bir DNA parçasını taşıyan canlıya transgenik canlı denilir. Transgenik hayvan üretiminde; mikroenjeksiyon yöntemi, sperm aracılığı ile gen transferi (SMGT), viral vektörler ile gen transferi, transfekte somatik hücrelerle SCNT gibi yöntemler kullanılmaktadır. SCNT ile transgenezis, genetik materyali çıkartılarak enüklee edilmiş bir oositin perivitellin aralığına, transfekte edilmiş somatik hücrenin transfer edilmesi ve ooplasta füzyonu ile gerçekleşmektedir. SCNT ile transgenik çiftlik hayvanlarının üretilmesi diğer yöntemlere göre maliyet ve hayvan refahı açısından daha uygun olmasına karşın, özellikle koyunlarda canlı yavru alımı oranları oldukça düşüktür.
Projenin ilk aşamasında somatik hücre kaynağı olarak erişkin koyun fibroblast ve embriyonik fibroblast hücre kültürleri elde edilecek ve kullanılıncaya kadar dondurularak saklanılacaktır. Somatik hücrelerin eGFP işaret geni içeren plazmit ile transfeksiyonunda poli(β-aminoester) (PBAE), çift tabakalı hidroksit bileşiği (LDH), modifiye Kitosan (mChi) esaslı nanopartiküller ve Lipofektamin® kullanılacaktır. Kullanılan nanopartiküllerin transfeksiyon etkinliği Akış Sitometrisi’nde değerlendirilecek, aynı zamanda hücrelerin apoptoz ve DNA metilasyon analizleri yapılacaktır. Analizler sonucunda hücreler selektif besi yerlerine ekilerek transfekte hücreler ayrılacaktır. Elde edilen transfekte hücre gruplarını yeniden programlamak için amacıyla kontakt inhibisyon ve serum açlığına bırakma yöntemleri yanında, roscovitine ve trichostatin A inhibitörleri kullanılacaktır. Yeniden programlama sonunda, hücre gruplarında hücre siklusu, apoptoz ve DNA metilasyon analizleri yapılacaktır. Yeniden programlama çalışmasında en iyi sonucu veren gruplar iki farklı yöntem (piezo ile intrasitoplazmik hücre enjeksiyonu ve geleneksel yöntem) ile koyun oositlerinde SCNT için kullanılacaktır. Üretilen transgenik-klon embriyolar in vitro kültüre edilerek gelişimleri takip edilecektir.
Çalışmada kullanılacak olan nanopartiküllerin koyun fibroblast hücreleri üzerinde in vitro transfeksiyon etkinliği tarafımızdan daha önce belirlenmiş (ve TPE ile EPO’ya patent başvuruları yapılmış) olmasına karşın, hücrelerde apoptoz oluşturma durumları, hücrelerin metilasyon seviyeleri ve bu hücreler kullanılarak SCNT ile üretilmiş embriyoların gelişimi üzerine ne tür bir etki edeceği konusunda bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Roscovitine ile sığırlarda çalışılmış olmasına karşın, koyun klonlama çalışmalarında somatik hücrelerin yeniden programlanmasında kullanılmadığı tespit edilmiştir. Trichostatin A’da ise koyun hücre kültüründe çalışılmış az sayıda yayın olup, sunulan çalışmada planladığı gibi hem nanopartikül etkileri ve diğer programlama grupları dikkate alınarak değerlendirilmemiş, hem de transgenik SCNT denenmemiştir.
Sunulan projede, transgenik
koyun elde edilmesi amacıyla transfeksiyon ajanı olarak kullanılan PBAE, mChi ve
LDH’ın transgenik-klon embriyo üretimi
üzerinde etkilerini belirlemek ve SCNT yönteminin başarısını artırmak öncelikli
hedefimizdir. Ayrıca hücre siklusu inhibitörleri Roscovitine ve Trichostatin
A’nın somatik hücrelerin yeniden programlanmasında geleneksel yöntemlerle
karşılaştırmalı olarak etkinliğinin ortaya koyulması hedeflerimiz arasındadır.
SCNT yönteminin etkinliğini geliştirmek ve başarı oranlarını artırmak ülkemizin
transgenik çiftlik hayvanı üretiminde ön plana çıkmasını sağlayacaktır. Bu
sayede hem ülkemizin Ulusal
Bilim ve Teknoloji Politikaları kapsamında stratejik bir önemi olan transgen
teknolojisi ile biyoterapötiklerin üretimine, hem de model hayvan üretimi
teknolojilerinin geliştirilmesine önemli bir katkı sağlanacaktır.