Akademik Veri Yönetim Sistemi
Yağcıoğlu S. (Yürütücü), Ak K., Pabuccuoğlu S. K., Pabuccuoğlu S., Birler S., Evecen M., et al.
TÜBİTAK Projesi, 1001 - Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Projelerini Destekleme Programı, 2021 - 2025
Günümüz ihtiyaçlarının karşılanmasında dişi yavru elde edilmesi, hem kaliteli damızlık yetiştirilmesi hem de süt sığırı işletmeciliğinde önemli katkı sağlayan bir unsurdur. Embriyo transferinde doğacak olan yavruların cinsiyetinin kontrol altında tutulması cinsiyeti belirlenmiş sperma kullanımını gündeme getirmiştir. Fakat cinsiyeti belirlenmiş embriyo elde etme çalışmalarında payetlerdeki sperma konsantrasyonunun düşük olması, üretilen kaliteli embriyo sayılarını olumsuz etkilemektedir. Bu nedenle, araştırmacılar sığırlardan in vivo oosit toplama (OPU) ve in vitro fertilizasyon (IVF) ile embriyo üretim teknolojisine yönelmiştir. Cinsiyeti belirlenmiş embriyo üretiminde, spermaya yapılan uygulamalar nedeniyle IVF oranları çok düşüktür (%2-10). Dolayısıyla, bu oranların artırılması için intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) yöntemine ihtiyaç duyulmaktadır. Ancak, sığırlarda ICSI yönteminin başarı oranları düşüktür (%20 civarı). Bu durumun nedenleri olarak; olgunlaşmış oositlerin sitoplazmasında yeterli glutatyon (GSH) rezervlerinin bulunmaması, reaktif oksijen türlerinin (ROS) artmış olması ve ATP miktarlarının azlığı sayılabilir. Diğer önemli nedenlerden biri de, boğa spermatozoon nükleuslarının protamin yapılarının etrafındaki disülfür bağlarının çok sıkı olması sebebiyle nüklear dekondenzasyonun şekillenememesidir. Bir başka neden ise, ICSI sonrasında oositlerin %90’ından fazlasının yeterli Ca2+ dalgalanmaları sağlanamadığından mayozu tamamlayamayıp, pronüklear gelişimlerin şekillenememesidir.
Çalışmanın amacı; ICSI protokolünde oosit maturasyonu, spermatozoon dekondenzasyonu ve oosit aktivasyonu gibi önemli aşamalara mühadele ederek, sığırlarda cinsiyeti belirlenmiş embriyo eldesinde başarı oranlarını artırmaktır. Bu amaçla; sığır oositlerinin sitoplazmik ve nüklear olgunlaşma seviyelerinin artırılması, boğa spermasının uygun nüklear dekondenzasyonunun sağlanması ve ICSI sonrası oosit ve spermatozoonların senkronize olarak pronüklear gelişimlerine devam edebilmeleri için aktivasyonlarının sağlanması hedeflenmektedir. Projenin ilk aşamasında, sığır oositlerinin sitoplazmik ve nüklear olgunlaşma seviyelerinin artırılması amacıyla 2-Oksotiyazolidin-4-karboksilat (OTC) ve butillenmiş hidroksitoluen (BHT) kimyasalları in vitro maturasyon medyumunda farklı konsantrasyonlarda uygulanacaktır. Uygulanan kimyasalların etkileri, olgunlaştırılmış oositlerin apoptoz ve nüklear gelişimleri ile GSH, ATP ve ROS seviyelerine bakılarak değerlendirilecektir. Deneme gruplarındaki oositlerin IVF ile elde edilen embriyolarının gelişimleri ve hücre sayımları incelenecektir. Ayrıca Metafaz II oositlerde; GSH, apoptoz ve blastosistlerde embriyonal gelişim potansiyelleri rt-PCR ile analiz edilecektir.
Projenin ikinci aşamasında, boğa spermatozoası protaminlerinde bulunan disülfür bağlarının redüklenmesi veya protaminleri bir arada tutan Zn2+’nun uzaklaşmasına bağlı olarak şekillenebilecek yeni disülfür bağlarını önlemek için, tiyoglikolik asit (TGA) ve fosfin bileşikleri [tris(2-karboksietil)fosfin(TCEP), tris(hidroksipropil)fosfin(THPP) ve bunların poli(β-aminoester) (PBAE) ile konjugatları] gibi indirgeyici ajanlar farklı konsantrasyonlarda cinsiyeti belirlenmiş boğa spermasında uygulanacaktır. Deneme gruplarının değerlendirilebilmesi için; sperma örneklerinde motilite ve diğer hız parametreleri, canlılık, akrozom bütünlüğü, kapasitasyon, DNA bütünlüğü ve protamin analizleri yapılacaktır.
Projenin üçüncü aşamasında, ICSI sonrası oositlerin aktivasyonu amacıyla, spesifik maturasyon uyarıcı faktör (MPF) inhibitörü Olomusin farklı konsantrasyonlarda uygulanacak, diğer bir MPF inhibitörü olan Roskovitin ve sığırlarda yaygın olarak uygulanan siklohekzimid (CHX) ile karşılaştırılacaktır. Deneme gruplarında, pronüklear ve embriyo gelişimleri ile hücre sayıları incelenecektir. Ayrıca, blastosistlerde embriyonal gelişim potansiyeli ile ilişkili olan genlerin değişimlerine rt-PCR ile bakılacaktır.
Projenin son aşamasında ise, iş paketlerinin en iyi grupları belirlenecek ve bu grupların beraber uygulanması sonucunda elde edilecek embriyolarda önceden belirtilen analizler gerçekleştirilecek ve embriyolar dondurularak eritme sonrası canlılık oranlarına bakılacaktır.
Çalışmanın sonucunda, oosit maturasyonu, sperm dekondenzasyonu ve oosit aktivasyonu gibi ICSI yönteminin önemli basamaklarında yapılacak iyileştirmeler ile ICSI sonrası sağlıklı embriyo gelişim oranlarının artırılması hedeflenmektedir. Bu hedef doğrultusunda, proje başarısı ile beraber cinsiyeti belirlenmiş sığır embriyosu eldesinde yöntem geliştirilerek ülkemiz ve dünya sığırcılık endüstrisinin ilerlemesine katkı sağlanacaktır.